Q1：YALEPIC 无缝克隆需要设计多长的同源臂序列？
A：本产品要求载体末端和插入片段同源序列15~25bp，单片段克隆优选 18~20bp 同源臂，6~11 个多片段组装建议 20~25bp 同源臂，可最大化重组效率，无需额外延长同源序列。
Q2：试剂盒最多能组装多少个 DNA 片段？
A：YALEPIC 通用型无缝克隆同源重组酶预混 Mix单次反应最高实现11 个 DNA 片段无缝拼接，市面常规同源重组试剂盒大多仅支持 3~6 片段；产品预混即用、样品免纯化，载体自连率更低、阳性率＞95%。
Q3：PCR 产物没有胶回收纯化，可以直接用这个试剂盒做无缝克隆吗？
A：可以，本试剂配方优化了杂质耐受度，未经胶回收的 PCR 粗产物、未纯化线性化载体直接投入重组反应即可，省去纯化步骤，节省实验耗材与时间。
Q4：无缝克隆标准反应温度和孵育时间是多少？可以延长反应时间吗？
A：标准条件50℃恒温 5~15min；常规单片段 5min 即可完成，8~11 个多片段建议 15min，不建议超过 30min，过长时间易引发非特异性重组。
Q5：阳性克隆率偏低、大量空质粒是什么原因，怎么解决？
A：①载体线性化不彻底：优化载体酶切 / PCR 线性化条件；②插入片段 PCR 非特异：胶回收纯化目的片段；③同源臂设计错误：修正引物同源区，改用 18~22bp 同源序列；本产品正常操作阳性率可达 95% 以上。
Q6：使用时载体和插入片段最佳摩尔配比是多少？
A：载体：插入片段摩尔比推荐1:2~1:3；多片段组装时，各个插入片段等摩尔添加，可显著提升多片段拼接成功率。
Q7：试剂盒 – 20℃保存反复冻融会影响酶活吗？
A：反复冻融会损伤重组酶活性，建议收到产品后分装为小规格，按需取用，剩余试剂继续 – 20℃避光保存。
Q8：这款试剂能不能用来做质粒定点突变实验？
A：完全适用，依托无缝无痕重组特性，是多位点定点突变优选试剂，无需引入酶切位点，直接通过同源重组实现质粒单点 / 多点突变改造。
Q9：试剂盒不含对照品，需要自行配置阴性对照吗？
A：产品出厂未配备阴性对照 Mix，用户可设置不加插入片段、仅加线性化载体的空白对照组，用来排查载体自连问题。
Q10：可以用该试剂盒构建基因筛选文库、CRISPR 文库吗？
A：适配高通量文库构建场景，1~11 片段灵活组装，高阳性率大幅降低文库筛选工作量，广泛用于 sgRNA 文库、随机 DNA 片段文库构建。
Q11：不同来源（平末端 / 粘性末端）的线性化载体都能用吗？
A：不受载体末端结构限制，酶切平末端、粘性末端、PCR 线性化的任意载体均可搭配本试剂盒完成无缝克隆，无载体类型限制。
Q12：100rxns 规格的试剂盒单次反应加样体系是多少？
A：常规 10μL 标准反应体系，MasterMix 添加 5μL，剩余体积由载体 + 各插入片段补水补齐，100rxns 规格可完成 100 次标准 10μL 反应。
