多糖多酚植物RNA提取实验操作步骤详解
柱式法与磁珠法双方案全流程指南 | 涵盖试剂清单 · 分步操作 · 质量检测 · FAQ · 产品选型
🤖 磁珠法 40min
🛡️ 免酚氯仿
📊 CV≤5%
🧪 多糖多酚通用
📌 内容摘要
本文详细介绍了多糖多酚植物RNA提取的两种主流方案——双柱法（YALEPIC® YR23016，10分钟室温完成）和磁珠法（YALEPIC® YMR91002，40分钟自动化高通量）。涵盖多糖多酚植物RNA提取难点分析、实验原理对比、完整操作步骤（样本研磨→裂解→去gDNA→RNA结合→洗涤→洗脱）、RNA质量检测标准（OD260/280、RIN值、电泳验证）、常见问题FAQ及产品选型建议。适用于水稻、拟南芥、玉米等常规植物及马铃薯块茎、葡萄果肉、中药材等高难度多糖多酚样本，所得RNA可直接用于RT-qPCR、RNA-Seq、Northern Blot等下游实验。
一、多糖多酚植物RNA提取的核心挑战
植物总RNA提取是分子生物学研究的基础操作，但当样本富含多糖和多酚时，常规提取方法往往难以获得高质量的RNA。这类”难提样本”在科研实践中极为常见，理解其提取难点是选择正确方案的前提。
多糖共沉淀
多糖的理化性质与RNA高度相似，在常规醇沉淀过程中会与RNA共沉淀，形成难溶的胶状物，导致RNA难以溶解、浓度测定失真，并严重抑制下游PCR和逆转录反应。
多酚氧化降解
多酚类物质在细胞破碎后迅速被内源多酚氧化酶氧化为醌类化合物，与RNA共价结合形成褐色不可逆复合物，导致RNA降解、产量骤降，提取液常出现明显褐变。
gDNA残留污染
多糖多酚样本裂解难度大，常需增加裂解强度，容易导致基因组DNA（gDNA）释放过多。残留的gDNA会干扰RT-qPCR定量结果，产生假阳性信号。
次生代谢物干扰
中药材、果实、块茎等组织富含萜类、生物碱、单宁等次生代谢物，这些物质不仅干扰RNA纯化，还可能抑制酶活性，影响后续逆转录和扩增效率。
📊 常见多糖多酚难提样本一览
| 样本类型 | 代表物种 | 主要干扰物 | 提取难度 |
|---|---|---|---|
| 块茎/块根 | 马铃薯、甘薯、山药 | 高含量多糖、淀粉 | ★★★★☆ |
| 果实/果肉 | 葡萄、草莓、苹果、柑橘 | 多酚、有机酸、多糖 | ★★★★★ |
| 中药材 | 丹参、黄芪、铁皮石斛、枸杞 | 多糖、黄酮、生物碱 | ★★★★★ |
| 种子/胚乳 | 大豆、花生、棉花种子 | 油脂、蛋白质、淀粉 | ★★★★☆ |
| 林木/茶叶 | 松针、茶叶、桉树叶 | 多酚、单宁、萜类 | ★★★★☆ |
* 提取难度基于多糖多酚含量及次生代谢物复杂程度综合评估，仅供参考。
二、实验原理：双柱法与磁珠法对比
目前针对多糖多酚植物RNA提取，YALEPIC®提供两种成熟的技术方案：硅基质膜双柱法和功能化纳米磁珠法。两种方法各有优势，可根据实验通量、自动化需求和样本类型灵活选择。
💡 选型建议：日常少量样本快速提取（1-12个）推荐柱式法 YR23016，10分钟出结果；大批量样本标准化提取（>12个）或需对接自动化平台推荐磁珠法 YMR91002，32样本同步处理且CV≤5%，结果更均一。
三、实验材料与试剂清单
3.1 试剂盒组分（柱式法 YR23016）
| 序号 | 组分名称 | 规格（50T） | 功能说明 |
|---|---|---|---|
| ① | YLA Buffer | 35 ml | 裂解液，快速裂解细胞并抑制RNase |
| ② | YLB Buffer | 35 ml | 结合促进液，促使RNA结合硅基质膜 |
| ③ | Wash Buffer RA | 42 ml | 洗涤液Ⅰ，去除蛋白质等杂质 |
| ④ | Wash Buffer RB | 60 ml | 洗涤液Ⅱ，去除盐离子及多糖残留 |
| ⑤ | IP Buffer | 25 ml | 辅助缓冲液 |
| ⑥ | RNase-free ddH₂O | 11 ml | 洗脱液，溶解洗脱RNA |
| ⑦ | Proteinase K | 550 μl | 蛋白酶K，降解蛋白（高蛋白样本可选） |
| ⑧ | Fast gDNA Filter Columns | 50 T | 快速去基因组DNA过滤柱（含收集管） |
| ⑨ | Pure Columns RT | 50 T | 高结合RNA纯化柱（含收集管） |
| ⑩ | Nuclease-free离心管（1.5 ml） | 50 T （赠送） | RNase-free收集管 |
⚠️ 首次使用注意：Wash Buffer RA 和 Wash Buffer RB 首次使用前需按瓶身标签指示加入指定体积的无水乙醇（分析纯），标记后室温保存。请勿遗漏此步骤，否则将严重影响洗涤效果。
3.2 试剂盒组分（磁珠法 YMR91002）
| 规格 | 货号 | 通量 | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| 标准版 | YMR91002 | 96T | 通用手动96孔 |
| 小规格 | YMR91002-A | 32T | 科研小试、单次≤32样本 |
| 中规格 | YMR91002-B | 48T | 常规实验室用量 |
| 预装版 | YMR91002-C | 96T | 预装磁珠，直接上机（Pure32） |
3.3 自备耗材与仪器
🧊 耗材
液氮、RNase-free离心管（1.5/2.0 ml）、RNase-free吸头（带滤芯）、研钵及杵（预冷）
⚙️ 仪器
台式高速离心机（≥13,000 rpm）、涡旋震荡器、移液器（10/200/1000 μl）、NanoDrop分光光度计
🧲 磁珠法额外
磁力架（96孔板式或管式）或全自动核酸提取仪（如雅礼Pure32）、深孔板
🔬 质控设备
琼脂糖凝胶电泳系统、Bioanalyzer/TapeStation（RIN值检测，可选）
四、柱式法操作步骤详解（YR23016）
✅ 方案特点：10分钟室温完成全流程 | 双柱联用去gDNA | 免酚氯仿 | 通用型（常规植物 + 多糖多酚 + 真菌）
以下操作步骤基于试剂盒说明书整理，具体试剂用量及参数请以产品随附说明书为准。首次使用前请务必完整阅读说明书。
📋 实验前准备
- 确认 Wash Buffer RA 和 Wash Buffer RB 已按标签指示加入无水乙醇
- 准备液氮、预冷研钵及杵、RNase-free离心管和吸头
- 设置离心机至室温，转速预调至 13,000 rpm（~12,000 × g）
- 在 RNase-free 离心管上标记样本编号
🧊 样本研磨与称量
取新鲜植物组织或 -80℃ 冻存样本（避免反复冻融），在液氮预冷的研钵中快速研磨至细粉状。全程保持液氮覆盖，防止RNase降解。
| 普通植物叶片 | 50–100 mg |
| 多糖多酚块茎/块根/种子 | 20–50 mg |
| 水果果肉 | 100–200 mg |
| 真菌菌丝 | 20–100 mg |
⚠️ 关键：研磨后立即将粉末转入预加裂解液的离心管，避免融化。多糖多酚样本建议适当减少投入量以避免柱堵塞。
🧪 加入裂解液（YLA Buffer）
- 向装有研磨粉末的离心管中加入适量 YLA Buffer（具体用量参见说明书）
- 立即剧烈涡旋震荡 15–30 秒，确保样本与裂解液充分混匀
- 室温静置 2–3 分钟，期间可间歇涡旋 1–2 次
- （可选）高蛋白样本（如种子）可加入 Proteinase K，室温孵育 5–10 分钟辅助消化
💡 原理说明：YLA Buffer 含特异性裂解成分和RNase抑制剂，可快速破坏细胞壁/膜结构释放RNA，同时抑制多酚氧化酶活性，防止RNA降解。
🔬 Fast gDNA Filter Columns 过滤除gDNA
- 将 Fast gDNA Filter Columns 置于配套收集管上
- 将步骤2的裂解液（含组织残渣）全部转移至滤柱中
- 室温 13,000 rpm 离心 1–2 分钟
- 收集滤液（含RNA），弃去滤柱（gDNA被截留在滤膜上）
⚠️ 如裂解液较粘稠（多糖多酚样本常见），可适当延长离心时间或加大转速。若滤液浑浊，可将滤液再次过柱一次。
🧬 RNA结合至 Pure Columns RT
- 向步骤3收集的滤液中加入适量 YLB Buffer（结合促进液）
- 涡旋混匀或移液器反复吹打 5–10 次
- 将混合液转移至 Pure Columns RT（RNA纯化柱，置于收集管上）
- 室温 13,000 rpm 离心 30–60 秒，RNA结合至硅基质膜
- 弃滤液，将纯化柱放回同一收集管
💡 原理说明：YLB Buffer 调节溶液离子环境，使RNA选择性结合到 Pure Columns RT 硅基质膜上，而多糖、多酚和蛋白质等杂质流穿。
🧹 洗涤（两次）
第一次洗涤 — Wash Buffer RA
- 向 Pure Columns RT 中加入 Wash Buffer RA（已加乙醇）
- 室温 13,000 rpm 离心 30–60 秒，弃滤液
第二次洗涤 — Wash Buffer RB
- 向 Pure Columns RT 中加入 Wash Buffer RB（已加乙醇）
- 室温 13,000 rpm 离心 30–60 秒，弃滤液
💡 原理说明：Wash Buffer RA 去除蛋白质等大分子杂质，Wash Buffer RB 进一步清除盐离子和多糖残留。两次洗涤确保RNA纯度满足下游实验要求。
💨 空柱离心干燥
- 将 Pure Columns RT 放回收集管
- 室温 13,000 rpm 离心 2 分钟（空柱）
- 彻底去除膜上残留的洗涤液（含乙醇）
🔴 关键：残留乙醇会严重抑制下游逆转录和PCR反应！务必充分离心去除。如仍有可见液滴，可开盖室温放置 2–3 分钟使乙醇挥发，但避免过度干燥导致膜龟裂。
💧 RNA洗脱
- 将 Pure Columns RT 转移至新的 RNase-free 1.5 ml 离心管
- 取 30–50 μl RNase-free ddH₂O，滴加至膜的正中央
- 室温静置 1–2 分钟（使洗脱液充分浸润膜面）
- 室温 13,000 rpm 离心 1 分钟，收集洗脱液即为总RNA
- （可选）为提高得率，可将洗脱液再次加回膜上，重复离心一次（二次洗脱）
💡 提高得率技巧：① 将洗脱液预热至 56℃ 可提高RNA溶出效率；② 减少洗脱体积（如 30 μl）可提高浓度但降低总产量；③ 二次洗脱可回收膜上残留RNA。
❄️ RNA保存
- 短期使用（1周内）：置于 -20℃ 保存
- 长期保存：置于 -80℃ 保存，避免反复冻融
- 建议分装保存，每次取用一份，避免反复冻融导致降解
🔬 柱式法全流程一览（~10 min）
→
🧪 YLA裂解
→
🔬 gDNA过滤
→
🧬 RNA结合
→
🧹 洗涤×2
→
💨 干燥
→
💧 洗脱RNA ✅
五、磁珠法操作步骤详解（YMR91002）
✅ 方案特点：40分钟完成 | 功能化纳米磁珠靶向纯化 | 可全自动高通量（Pure32） | CV≤5% | 中药材/果实/块茎等高难度样本适用
以下步骤适用于手动磁力架操作及自动化平台。使用全自动提取仪（如雅礼Pure32）时，将试剂加入深孔板后按仪器程序运行即可。具体参数请以产品随附说明书为准。
🧊 样本研磨与称量
- 取新鲜或 -80℃ 冻存植物组织，液氮研磨至细粉
- 称取 30–100 mg（湿重），根据组织类型调整：
- 叶片/茎：50–100 mg
- 块茎/果实/种子：30–50 mg（高多糖建议偏低量）
- 中药材：30–80 mg
- 将粉末迅速转入预冷的 RNase-free 离心管或深孔板
🔴 不建议超过 100 mg。超量易导致裂解不充分、杂质过载，反而降低RNA质量。
🧪 裂解
- 加入适量裂解缓冲液，涡旋剧烈震荡 15–30 秒
- 室温孵育 5 分钟，期间间歇涡旋 2–3 次
- 室温 13,000 rpm 离心 3–5 分钟
- 小心吸取上清液（含RNA）至新的离心管/深孔板，避免吸入沉淀
💡 原理说明：定制缓冲体系有效裂解植物细胞壁/膜，同时抑制多酚氧化酶和RNase活性，为后续磁珠结合创造最佳条件。
🧲 磁珠结合RNA
- 使用前将功能化纳米磁珠充分涡旋混匀（磁珠易沉降，确保均匀悬浮）
- 向步骤2上清液中加入适量磁珠悬浮液和结合缓冲液
- 移液器反复吹打 10 次或涡旋混匀，使磁珠与RNA充分接触
- 室温孵育 5 分钟，期间每隔 1–2 分钟混匀一次，保持磁珠悬浮状态
💡 原理说明：功能化纳米磁珠表面修饰基团在特定缓冲条件下选择性结合RNA分子，多糖、多酚等杂质因不具亲和力而留在溶液中。
🧹 磁分离与洗涤（3次）
洗涤1
- 将管/板置于磁力架上，静置 1–2 分钟至磁珠完全吸附于侧壁
- 溶液澄清后小心吸弃上清（勿触碰磁珠）
- 移开磁力架，加入洗涤液1，涡旋或吹打混匀 30 秒
洗涤2
- 磁分离 1 分钟，弃上清
- 加入洗涤液2，吹打混匀 30 秒
洗涤3（重复洗涤2）
- 磁分离 1 分钟，弃上清
- 尽量吸尽残留液体
⚠️ 多糖多酚样本建议确保完成全部3次洗涤，以充分去除多糖和多酚残留，保证下游PCR不受抑制。
🧬 DNase I 消化去gDNA（可选/推荐）
- 配制 DNase I 工作液：DNase I + 10× DN Buffer（按说明书比例配制）
- 向磁珠沉淀中加入 DNase I 工作液，轻轻吹打混匀
- 室温孵育 10–15 分钟，消化结合在磁珠上的基因组DNA
- 加入终止液或直接进行一次额外洗涤，去除DNase I及消化产物
💡 对于RT-qPCR等对gDNA残留敏感的实验，建议执行此步骤。DNase I 需 -20℃ 保存，使用时置于冰上融化。
💨 磁珠干燥
- 完成最后一次洗涤后，尽量吸尽残留液体
- 开盖室温放置 2–5 分钟，使乙醇挥发
- 磁珠表面呈湿润光泽状即可，避免过度干燥（磁珠结块会降低洗脱效率）
💧 RNA洗脱
- 加入 30–50 μl 洗脱缓冲液（或 RNase-free ddH₂O）至磁珠中
- 吹打混匀或涡旋 10 秒，使磁珠充分悬浮
- 室温孵育 2–3 分钟，期间混匀 1–2 次
- 置于磁力架上 1–2 分钟，待磁珠完全吸附
- 小心吸取上清液至新的 RNase-free 离心管，即为总RNA溶液
🤖 自动化方案（Pure32）
- 选用 YMR91002-C 预装磁珠规格，开盒即上机，无需手动分装
- 将试剂板和样本板置于雅礼Pure32全自动核酸提取仪
- 选择对应程序，启动运行，全流程≤40分钟，32样本同步处理
- 仪器自动完成裂解→结合→洗涤→洗脱全流程，CV≤5%，结果高度可重复
🧲 磁珠法全流程一览（~40 min）
→
🧪 裂解离心
→
🧲 磁珠结合
→
🧹 洗涤×3
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🧬 DNase I
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💨 干燥
→
💧 洗脱RNA ✅
六、RNA质量检测与评估标准
RNA质量直接影响下游实验结果的可靠性。建议从完整性、纯度和浓度三个维度进行综合评估。
📊
完整性检测
方法：1.2% 琼脂糖凝胶电泳
合格标准：28S 和 18S rRNA 条带清晰，28S 亮度约为 18S 的 2 倍，无明显弥散带
✅ 可选：使用 Bioanalyzer/TapeStation 检测 RIN 值，RIN ≥ 7 适合 RNA-Seq 建库
🌈
纯度检测
方法：NanoDrop 分光光度计
OD₂₆₀/₂₈₀ = 1.8 ~ 2.1（合格）
OD₂₆₀/₂₃₀ = ≥ 1.8（合格）
OD₂₆₀/₂₈₀ < 1.8 提示蛋白残留；OD₂₆₀/₂₃₀ < 1.5 提示多糖/盐残留
📏
浓度检测
方法：NanoDrop（粗测）/ Qubit 荧光定量（精测）
参考浓度：因样本类型和投入量而异，一般植物叶片RNA浓度在 50–500 ng/μl 范围
⚠️ 多糖残留会导致NanoDrop浓度读数偏高（多糖在260nm有吸收），Qubit检测可排除此干扰
📋 RNA质量评估标准汇总表
| 检测项目 | 检测方法 | 合格范围 | 异常提示 | 下游应用建议 |
|---|---|---|---|---|
| 完整性 | 琼脂糖凝胶电泳 | 28S:18S ≈ 2:1 | 弥散带→降解 | RT-PCR / qPCR / Blot |
| RIN值 | Bioanalyzer | RIN ≥ 7 | RIN < 6→降解严重 | RNA-Seq建库需RIN≥7 |
| OD₂₆₀/₂₈₀ | NanoDrop | 1.8 ~ 2.1 | <1.8→蛋白残留 | 所有下游实验 |
| OD₂₆₀/₂₃₀ | NanoDrop | ≥ 1.8 | <1.5→多糖/盐残留 | RT-qPCR（敏感） |
| gDNA残留 | 无RT对照PCR | 无扩增 | 有扩增→gDNA残留 | RT-qPCR必须检测 |
* 以上质量参数为通用参考标准，具体要求因下游实验类型而异。部分数值为示意数据，以产品随附COA及第三方检测报告为准。
🎯 YALEPIC® 提取RNA的下游应用场景
RT-qPCR（荧光定量）
RNA-Seq（转录组测序）
Northern Blot
Dot Blot
芯片分析
Poly(A)筛选
体外翻译
RNase保护分析
分子克隆
七、常见问题与解决方案（FAQ）
八、产品推荐与选型指南
LEPIC® 磁珠法系列
📊 一分钟选型决策表
| 您的需求 | 推荐产品 | 推荐理由 |
|---|---|---|
| 少量样本，要求快速出结果 | YR23016 | 10min极速完成，操作简便 |
| 常规植物叶片RNA提取 | YR23016 | 性价比高，通用性强 |
| 中药材、果实、块茎等高难度样本 | YMR91002 | 磁珠靶向纯化，抗干扰能力更强 |
| 大批量样本（>12个）需同步提取 | YMR91002-C | 预装版直接上机，32样本40min |
| RNA-Seq建库用RNA | YMR91002 | CV≤5%，批次间一致性高 |
| 教学实验室、无危化品处理条件 | YR23016 | 免酚氯仿，安全环保，室温保存 |
九、实验注意事项
🔴 RNase污染防控
- 全程使用RNase-free耗材（离心管、吸头带滤芯）
- 操作前用75%乙醇擦拭台面和移液器
- 佩戴一次性手套，操作中勿触摸面部
- 区分RNA操作专区与DNA操作区
🟠 样本处理要点
- 新鲜样本取材后立即液氮速冻或直接使用
- -80℃保存样本避免反复冻融，建议分装
- 研磨全程保持液氮覆盖，勿让样本融化
- 多糖多酚样本适当减少投入量
🔵 试剂使用注意
- 首次使用前Wash Buffer需加无水乙醇
- 磁珠使用前充分涡旋混匀（易沉降）
- DNase I需-20℃保存，使用时冰上融化
- 各Buffer出现沉淀时37℃温浴溶解后使用
🟣 洗脱与保存
- 洗脱液务必滴加至膜/磁珠中央
- 残留乙醇必须充分去除后再洗脱
- RNA分装保存，避免反复冻融
- 长期保存置于-80℃，勿置于-20℃长期存放
🟢 自动化操作注意
- 使用Pure32前确认程序参数设置正确
- 预装磁珠板（YMR91002-C）开封后尽快使用
- 深孔板加样时避免气泡产生
- 定期校准仪器磁棒/磁力架位置
📞 技术支持与订购
服务热线：0512-66256010 | 邮箱：info@yalibiotech.com
官网：www.yalibiotech.com | 国家高新技术企业 · 雅礼生物 YALEPIC®
