YALEPIC^® 无内毒素质粒DNA大量提取试剂盒（100-300ml）

YALEPIC^®无内毒素质粒 DNA 大量提取试剂盒(100-300ml）采用新型硅基质膜吸附技术，在经典碱裂解法基础上，结合高效内毒素去除Buffer体系，可从100-300 ml大肠杆菌菌液中快速提取转染级高纯度质粒DNA。独特的蓝色指示剂系统实时指示裂解与中和状态，实现操作全程可视化，有效避免因裂解不足或过度导致的质量问题。整个提取流程仅需45分钟，产量达2-3 mg（高拷贝质粒），内毒素残留低（<1 EU/μg DNA），纯度A260/280比值1.8-2.0。所得质粒DNA可直接用于HEK293细胞转染、基因编辑（CRISPR-Cas9）、慢病毒包装、动物体内注射及酶切、PCR、测序等下游分子生物学实验，是基因治疗载体构建、细胞转染及动物实验的理想选择。

• 菌液处理量：100 ~ 300 ml 大肠杆菌菌液（高拷贝/低拷贝质粒均可）

• 细胞转染：HEK293、CHO、Huh7、HeLa等哺乳动物细胞高效转染

• 基因编辑：CRISPR-Cas9、TALEN等基因敲除/敲入实验

• 病毒包装：慢病毒、腺相关病毒（AAV）载体质粒制备

• 动物实验：尾静脉注射、瘤内注射等体内实验

• 分子克隆：酶切、连接、转化、测序、PCR、体外转录、无细胞表达体系

常温运输；10 ~ 30℃ 常温保存。

Q1：质粒大提试剂盒如何处理100-300 ml菌液？产量大概是多少？

A：本试剂盒单次可处理100~300 ml新鲜过夜培养的大肠杆菌菌液。对于pUC系列等高拷贝质粒，300 ml菌液可获得2-3 mg质粒DNA；对于pBR322等低拷贝质粒，建议使用300 ml菌液，产量约为500-800 μg。实际得率与质粒拷贝数、宿主菌株、培养条件等因素有关。

Q2：质粒中的内毒素对转染实验有什么影响？为什么一定要去除？

A：内毒素（脂多糖LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的成分，在质粒提取过程中容易残留。内毒素会：①显著降低敏感细胞的转染效率；②激活免疫细胞产生非特异性反应，导致假阳性结果；③引起细胞毒性，造成细胞凋亡；④在动物实验中会引发发热、内毒素性休克等不良反应。因此，用于细胞转染和动物实验的质粒必须将内毒素残留控制在极低水平–。

Q3：本试剂盒的内毒素残留水平是多少？是否满足动物实验要求？

A：本试剂盒提取的质粒DNA内毒素残留量<1 EU/μg DNA，内毒素去除率>99%。该水平符合大多数哺乳动物细胞转染及小鼠尾静脉注射等动物实验的要求，也满足国家药监局对基因治疗用质粒的内毒素控制标准。

Q4：蓝色指示剂的作用是什么？如何判断裂解是否完全？

A：本试剂盒预混了蓝色指示剂组分。菌体悬浮液加入裂解液后，溶液由浑浊变为澄清蓝色，表明细菌细胞壁完全裂解，质粒已充分释放；加入中和液后，溶液由蓝色变为无色并产生白色絮状沉淀，表明中和反应完成、蛋白质和基因组DNA充分沉淀。通过颜色变化可直观判断每个操作步骤是否到位，有效避免因裂解不足或过度导致的质量问题，特别适合新手操作。

Q5：提取过程中溶液出现沉淀怎么办？是否影响使用？

A：如Buffer PA、Buffer PB或Buffer ER在保存过程中出现沉淀，此为正常现象，尤其冬季低温环境下更易发生。使用前请将试剂瓶置于37℃水浴中加热10-15分钟并充分颠倒混匀，待沉淀完全溶解后即可正常使用，不影响提取效果。注意：RNase A加入Buffer PA后，需4℃保存并在6个月内使用完毕。

Q6：质粒产量低于预期是什么原因？如何提升？

A：产量偏低通常与以下因素有关：①菌液培养时间过长（>16小时），质粒丢失或降解；②菌液OD600值过低（<2.0），细菌数量不足；③低拷贝质粒（如pBR322、pACYC）本身的拷贝数限制；④裂解不充分，质粒未完全释放。建议：高拷贝质粒使用100-150 ml菌液，培养时间控制在12-16小时，OD600达到2.0-4.0时收集菌体；低拷贝质粒建议直接使用300 ml菌液。

Q7：本试剂盒可以提取BAC/PAC等大型质粒吗？

A：本试剂盒采用硅胶膜吸附技术，对<20 kb的质粒提取效果最佳。对于BAC（细菌人工染色体）、PAC（P1衍生人工染色体）等>20 kb的大型质粒，硅胶膜吸附效率和产量会有所下降，且过柱过程可能对大分子质粒造成剪切损伤。如需要提取BAC/PAC等大型质粒，建议选用离子交换法或溶液型试剂盒。

Q8：转染后细胞死亡率高，是否与质粒纯度有关？

A：细胞转染后死亡率高可能由多种因素导致，包括：①质粒内毒素残留超标——内毒素对细胞具有直接毒性，是导致细胞死亡率升高的重要原因；②转染试剂本身对细胞有毒性；③质粒DNA溶液中残留乙醇或异丙醇；④质粒纯度不足（A260/280偏离1.8-2.0范围）。建议首先检测质粒的A260/280比值和内毒素水平，确保使用无内毒素质粒进行转染实验。

Q9：试剂盒可以在常温下运输和保存吗？有效期多久？

A：可以。本试剂盒所有组分均可在常温（15-30℃）条件下运输和保存，无需冷冻或冷藏，大大降低了运输和储存成本。在室温干燥条件下，试剂盒整体有效期为18个月。但请注意：单独包装的RNase A在-20℃可稳定保存更长时间；RNase A加入Buffer PA后，需在4℃保存并于6个月内使用完毕。

Q10：提取的质粒DNA可以用于哪些下游实验？

A：本试剂盒提取的质粒DNA纯度高、内毒素极低，可广泛应用于：哺乳动物细胞转染（HEK293、CHO、Huh7等）、CRISPR-Cas9基因编辑、慢病毒/AAV病毒包装、动物体内注射实验、酶切鉴定、PCR扩增、Sanger测序、连接转化、体外转录和无细胞表达体系等。若用于临床研究或基因治疗开发，建议额外进行内毒素含量检测以确保符合相应标准。

Q11：本试剂盒与其他竞品相比有何优势？

A：核心差异体现在以下方面：①可视化操作——本试剂盒裂解液和中和液均含有蓝色指示剂，对于新手操作友好度更高；②时间效率——45分钟完成全流程；③性价比——YC47013-10规格目录价650元/10次，相比同类产品具有价格优势，促销期间价格优势更为明显。当然，建议用户根据具体实验需求、质粒类型和预算综合选择。

Q12：从收到试剂盒到开始实验，需要提前准备哪些设备和耗材？

A：本试剂盒提供除常用设备和试剂外的所有组分。用户需自备：①可容纳50 ml离心管的离心机（建议最大离心力≥12,000×g）；②恒温摇床（37℃）；③无水乙醇（用于漂洗液配制）；④100-300 ml细菌培养瓶及相应培养基；⑤微量离心管（1.5 ml/2 ml）；⑥微量分光光度计（用于质粒浓度和纯度检测）。无需自备酚、氯仿等有机溶剂。