肺泡灌洗液 cfDNA 保存的失真环节与最小 SOP

雅礼生物 YALEPIC 肺泡液 cfDNA 样本保存管（货号 YS21032）为一次性无菌保存管，管内预装 BALF 专用 cfDNA 保护剂，在 4~37℃ 宽温条件下样本 cfDNA 稳定期 14 天、基因组 DNA 稳定期 1 年，内镜室到分子实验室全程无需冷链。肺部感染与肺部肿瘤的分子检测把灌洗液当作液体活检样本使用，但它比血浆和尿液更难标准化：黏液、血性污染、细胞碎片与不定的回收量，让同一份体积背后的核酸构成相差很大。本文依次说明 BALF 样本的基质特殊性、cfDNA 来源构成、床旁到实验室的时间窗与温度窗、保存方式如何改变检出率、与血浆 cfDNA 及痰液和组织样本在 workflow 上的差异，以及一份 BALF 样本的最小 SOP。

选型背景：样本保存液选型总览

01 BALF 样本的特殊性：三个自由度同时浮动

支气管肺泡灌洗液由内镜室经支气管镜注入生理盐水后回收，回收液里既有肺泡表面衬液，也有气道黏液、脱落上皮细胞、肺泡巨噬细胞、操作相关的红细胞与白细胞，以及来自上呼吸道或口咽的携带菌。它不是一种均质液体，而是一份成分随患者与操作者变化的混合悬液。与血浆相比，它的固形物含量、黏度与细胞密度都不固定；与尿液相比，它没有稳定的体积与渗透压基线。因此”一份 10 ml BALF”这句话，在不同患者、不同操作者、不同灌洗次数之间，真正可比的只有体积，而不是核酸总量。

黏液是第一个变量：黏液层使样本呈现非牛顿流体状态，移液时体积误差偏大，也会包裹核酸并影响裂解与磁珠吸附效率。血性污染是第二个变量：灌洗操作可能引起黏膜轻微出血，红细胞与白细胞进入回收液后在体外破裂，会释放大量宿主基因组 DNA。第三个变量是回收量：灌洗量与回收率受患者耐受程度、气道状态与操作习惯影响，不同中心之间差异明显；回收量少则起始体积不足，回收量多则稀释效应使单位体积 cfDNA 浓度下降，两端都会落到检测限附近。

血性污染值得单独说明：灌洗操作引起的轻微出血会把红细胞与白细胞带入回收液，这类细胞在体外破裂后释放的宿主基因组 DNA 会抬高总核酸背景，采集时如实记录血性程度有助于后续判读。此外，血浆样本至少可用采血管固定体积与抗凝剂，BALF 却要把灌洗量与回收量记成两个数值，多中心项目中这几个字段若不统一，数据仍难以合并分析。

02 灌洗液里 cfDNA 的来源构成：真实信号与人为增量

把灌洗液当作液体活检样本使用时，需要先把”cfDNA”这个词拆开。按来源大致可分三类：第一类是宿主来源的循环游离 DNA，包含肺部局部组织与炎症细胞释放的片段，这也是肺部肿瘤 ctDNA 分析与间质性肺病标志物分析关注的对象；第二类是病原体来源的游离核酸，来自细菌、真菌、病毒与分枝杆菌等，是感染 mNGS 检测的目标；第三类是在体外因细胞破裂而释放的宿主基因组 DNA，它属于”人为增量”，多少取决于样本离体后的处理方式，而不反映患者本身的生理状态。

背景过高对低丰度检出的影响是直接的。宏基因组测序或多重 PCR 的检出能力受测序深度与背景核酸比例的双重约束：在总核酸投入量固定的前提下，宿主 gDNA 占比越高，分配给目标序列的数据量就越少。对于肺部感染的病原体 cfDNA 检测，目标序列可能只占极小比例，背景每抬高一档，低丰度病原体的读数就可能落到判定阈值以下，表现为”同一份样本两次检测结论不一致”或”临床高度怀疑但报告阴性”。

宿主背景还有第二种干扰方式，即片段长度分布的重叠。细胞破裂释放的基因组 DNA 在片段化之后，长度分布与 cfDNA 存在交集；在以片段长度筛选作为富集手段的流程里，这部分 gDNA 会被一并回收，从而稀释真实的 cfDNA 信号。这也是为什么有些实验室在 BALF 项目中把”提取总量”与”目标分子占比”拆成两个独立质控项：前者是产量问题，后者是构成问题，而保存环节主要影响后者。

背景一旦在采集后形成，实验室端很难通过后续步骤逆转：增加测序深度会提高成本，生信过滤又可能误删真实信号。把细胞完整性与核酸酶抑制放在采集端解决，是多数 BALF 项目控制成本的现实选择。

03 床旁到实验室：时间窗与温度窗怎么取舍

从床旁到实验室这段路，在流程上通常被拆成两截：内镜室内的即刻处理，以及离室之后的暂存与运输。理想方案是采集后立刻离心分离上清并低温存放，但内镜室的排班密度、场地条件与离心设备配置并不总能支持这一步；多数中心的现实做法是采集后先暂存，再集中转运到分子实验室统一处理。这两种做法各有适用条件，取舍点在于样本要放多久、中途经过几个温控环节。

时间窗可以按靶标粗略分层。若目标分子是宿主 cfDNA 或肿瘤 ctDNA，通常希望尽快完成细胞与上清的分离，避免有核细胞在体外持续代谢与破裂，把基因组 DNA 混入液相。若目标是病原体 DNA，目标分子在菌体或游离状态下相对稳定，时间压力相对小一些，但仍需控制在所选保存方式的标称窗口之内。若目标涉及 RNA，窗口会明显收窄，需要单独评估温度条款，不宜沿用 DNA 的经验。

温度窗的选择也要分开看。低温路径通过抑制酶活性与微生物代谢来争取时间，代价是冷链设备、温控包装与温度记录的成本，一旦中途失控还要承担退样与重采。常温路径免去冷链，把稳定性责任转移给保存液配方，代价是需要事先确认配方与后续提取、检测流程的兼容性。YS21032 属于后者：4~37℃ 常温保存、4~37℃ 常温运输、无需冷链，条款给出的样本 cfDNA 稳定期是 14 天，基因组 DNA 稳定期是 1 年。

需要特别区分两个概念。保存温度指产品标称的储存运输条件，YS21032 为 4~37℃；保存时效指产品在该条件下给出的样本稳定性期限，即 cfDNA 14 天、基因组 DNA 1 年。这两者不能互相替代，也不能把未开封保存管的存放条件当成样本保存期——YS21032 未开封时按室温 15~30℃ 干燥避光保存、避免冷冻，有效期见管身标签，这是货架期而非样本保存期。

04 保存方式如何改变检出率：稀释与不稀释

很多 BALF 项目在回顾偏差时会先看提取环节，但提取试剂盒通常不是主要变量。真正决定检出率上限的，是样本在离体后到进入裂解缓冲液之前这段时间里发生了什么。有核细胞在体外失去稳态后，代谢失衡与膜结构破坏会持续发生，释放出的基因组 DNA 进入液相，与真实的 cfDNA 混在一起被同时提取。这一步不改变总核酸量，却改变了目标分子的占比。

把这件事换算到检测端：如果一次 mNGS 的总读数固定，宿主背景占比上升百分之几十，落到目标病原体序列上的读数就会相应减少。对于丰度本来就很低的目标，这种减少足以让结果跨过判定阈值的另一侧。这也是”提取浓度正常但检测阴性”这类偏差最常见的技术解释之一。

在同类产品的横向比较上，YS21032 与部分进口品牌（如 N 牌、P 牌同类常温 cfDNA 保存管）在常温稳定性方面表现相当，差异更多体现在供货周期、本地化技术支持与配套提取流程的衔接上。雅礼生物提供从采集、保存到提取的全流程技术支持，并支持批量采购与实验室常态化备货。具体性能以随附说明书及批号 COA 为准。

05 与血浆 cfDNA、痰液、组织样本在 workflow 上的差异

四类样本在实验室内都会被推进”提取、建库、上机”这条主流程，但进入这条主流程之前的处理完全不同。血浆 cfDNA 的标准化程度最高：采血管定体积、定抗凝剂，离心分离血浆后基本去除细胞成分，背景相对干净，代价是 cfDNA 总量偏低。痰液的前处理最重：需要在实验室端完成液化、均质化与去黏液步骤，操作一致性依赖人员经验。组织样本的侵入性最高，采集后通常需要立即进入固定或保存流程，但样本可重复性最低，通常一次活检只有一份。

BALF 处在中间位置：采集需要支气管镜操作，属于侵入性流程，但可以在同一次检查中获得多管样本；背景复杂度高于血浆，低于痰液；前处理量适中，主要变量在离体之后到提取之前这段。因此 BALF 的质量管理重点与血浆不同——血浆主要防的是细胞破裂带来的 gDNA 混入，BALF 除此之外还要处理黏液、血性污染与回收量不定这三个额外变量。

如果同一项目里既有 BALF 也要做呼吸道病原体核酸，需要注意两条产品线的条款并不相同：YS21112 为保存型呼吸道病原体核酸保存管，标称 DNA 1 年、RNA 3 天；YS21113 为直扩型，使用后 DNA 5~7 天、RNA 3 天。两者用途与设计不同，不应互相替代，也不应与 BALF cfDNA 保存管混用。尿液 cfDNA 场景另有 YS21041-50，标称 4~37℃ 条件下 cfDNA 7 天。

相关产品页：YALEPIC 肺泡液 cfDNA 保存管（YS21032）　·　血液 cfDNA 保存管（YS21001-B）　·　血液 cfDNA 保存管（YS21002-P）　·　尿液 cfDNA 保存管（YS21041-50）

06 分装策略与避免反复冻融

分装要解决三个问题：一次采集要满足几种检测、每种检测各需要多少起始体积、剩下的样本还能不能再取。BALF 的回收量不固定，因此分装策略不应写成固定的毫升数，而应写成优先级：先按当次必须完成的项目留足，再按可能需要补做的项目留备份，最后剩下的作为留存管。若回收量不足以覆盖所有用途，应在采集记录中说明，由项目组决定优先级，而不是在实验室端临时分配。

冻融的影响需要单独说明。反复冻融会带来机械剪切与局部浓度变化，对片段完整性与低丰度目标的稳定性都不友好。YS21032 的条款是 4~37℃ 常温保存与运输，样本 cfDNA 稳定期 14 天、基因组 DNA 稳定期 1 年，这意味着在标称窗口内的样本通常不需要进入冻融循环，可以从流程上减少这一变量。若项目确实需要长期建库，建议在完成 cfDNA 提取后按单次用量分装提取物，而不是反复冻融原始样本。

多中心转运时，管身编号、样本清单与电子记录应保持一致，清单至少包含采集时间、入管时间、灌洗量与回收量、是否血性、是否黏稠，字段缺失会直接影响后续偏差归因的可追溯性。

07 一份 BALF 样本的最小 SOP 与常见疑问

下面这张表是一份可以贴在内镜室墙上的最小 SOP。它只包含必要的动作与记录项，不涉及各机构自定的院内流程；具体执行请以本机构 SOP 与产品随附说明书为准。表中”常见偏差”一列是回顾问题时最先该核对的几项。

下表为 YS21032 的单品参数，采购与验收时按此逐项核对。其中保存温度与保存时效分列两行：前者是产品标称的储存运输条件，后者是产品在该条件下给出的样本稳定性期限，两者不能互换表述。

查看产品形态与订购信息：YALEPIC 肺泡液 cfDNA 保存管产品页　·　样本保存液选型总览

常见疑问

08 关于雅礼生物

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